Простые питательные среды мясопептонный агар. Простые питательные среды • Мясо-пептонный бульон (МПБ) Приготовление реактива Е

Простые питательные среды Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Готовят на мясной воде с добавлением готового пептона. Пептон – продукт неполного переваривания (гидролиза) белка, используется как источник азота и углерода. Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путём добавления к МПБ 1, 5 – 3% a г ap — a г apa. Агар-агар – продукт из морских водорослей, содержит высокомолекулярные полисахариды

Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других (за счет добавления в среду определённых компонентов). Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения. Например, среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавляют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.

Дифференциально-диагностич еские среды позволяют отличить один вид микроба от другого на основании разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входят: — основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, — определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, — индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о расщеплении субстрата и образовании конечных продуктов.

Среда Эндо Состав: питательный агар, лактоза, основной фуксин. Среда имеет розовый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в темно-красный цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.

Среда Левина Состав: питательный агар, лактоза, эозин и метиленовый синий. Среда имеет коричневатый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в темно-синий цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.

Среда Плоскирева Состав: питательный агар, лактоза, нейтральный красный, соли желчных кислот, бриллиантовый зелёный. Среда имеет розовато-желтоватый оттенок. Колонии бактерий, ферментирующих лактозу, окрашиваются в бруснично-красный цвет; колонии бактерий, не ферментирующих лактозу, остаются бесцветными.

Техника посевов Метод Дригальского: Каплю исследуемого материала вносят в первую чашку Петри и стерильным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга и будут образовываться изолированные колонии. Посев петлёй параллельными штрихами

Посев петлёй параллельными штрихами Колония - это видимое изолированное скопление представителей одного вида микроорганизмов, образующееся при размножении одной бактериальной клетки на плотной питательной среде. Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по культуральным признакам.

Мясопептонного агар (МПА) — самое распространенное универсальное питательную среду в микробиологических исследованиях.

Состав

• ферментативный пептон
• экстракт мяса (1: 2)
• натрия хлорид
• глюкоза

Описание

Препарат представляет собой плотное питательную среду желтого цвета.

Выпускается в виде плотной питательной среды по 300 мл в стеклянных флаконах, откупоренных пробками завальцованы алюминиевыми колпаками.

Назначение

Используется для культивирования и изучения культуральных свойств различных микроорганизмов.

Возможно использование препарата как питательной основы для приготовления различных питательных сред целевого назначения.

Хранение

Срок годности — 2 года. Сохраняется среда герметично закрытым при температуре от 2 до 25 ° C в местах, защищенных от воздействия прямых солнечных лучей.

Приготовление

До 1 л мясо-пептонам бульона добавляют 15-20 г мелко нарезанного агар-агара. Среда нагревают до растворения агара (температура плавления его 100 ° С, застывания -40 ° С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20% -ным раствором Na2CO3, a и через воронки разливают в пробирки (но 10 мл для розливок в чашки — агар столбиком и по 5 мл для получения скошенного, наклонного агара). При разливке агара необходимо следить затем, чтобы края пробирки были сухими, иначе пробки прилипают к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 ° С в течение 20 мин.

Существует и другой вариант среды — мясо-пептона желатина (МПЖ), где вместо агара для затвердевания среды используют желатин. В 1 л бульона мясопептонного добавляют 100-150 г желатина. Температура плавления зависит от процентного содержания в среде. 10% желатина плавится при 24 ° С, 15% — при 25 °. В летнее время среды готовят, добавляя 15% желатины. После растворения желатина при осторожном нагревании в среде устанавливают слабощелочную реакцию (как и для МПБ и МПА), кипятят в течение 5 мин, затем охлаждают-до 40-50 ° С Одновременно яичный белок взбивают с небольшим количеством воды, вливают его в охлажденную желатиновую среду, хорошо взбалтывают и снова нагревают. Среда после выпадения белков становится прозрачным. Его фильтруют через горячую воронку, разливают в пробирки и стерилизуют в кипятильнике Коха текучим паром, прогревая среду по 30 мин через 24 ч три раза.

К 100 мл мясного бульона добавляют 1 % пептона Пептон- это продукт ферментативного гидролиза белков. Добавляют пептон в среду для увеличения ее питательности, для уплотнения среды в нее добавляют от 2 до 4 % агар-агара

Питательная среда д.б. слабокислой по отношению к цитоплазме микроорганизмов, которые будут выращиваться в ней. Для этого в среду добавляют 0,5% поваренной соли. Реакция среды от 7,0 до 7,4. После введения агар-агара смесь прогревают до неполного студнеобразования.

Приготовление мясо-пептонного желатина.

Эта среда готовится аналогично МПА, но для уплотнения ее применяют на агар-агар, желатин в количестве 10-12% . МПЖ имеет ряд преимуществ перед МПА. Он Лучше соединяется со стеклом, гнилостные бактерии образуют при росте на этой среде весьма характерные колонии, кроме того, некоторые из гнилостных бактерий обладают способностью разжижать желатин, что очень важно для определения вида бактерий. Но МПЖ" плавится при температуре 30-37 0 С, в этом его недостаток.

Дня изучения биохимических признаков микроорганизмов пользуются дифференциально-фагностическими средами. Примером таких сред могут служить среды Гисса. Их применяют для изучения способности м.о. ферментировать углеводы.

В состав сред Гисса входит 1% какого-либо углевода, 1% агар-агара и индикатор. Примером такой среды является и среда Эндо, применяемая для выделения Bact. coli. В состав этой среды входит, кроме МПА, насыщенный спиртовой раствор фуксина, 1% лактозы Na 2 SO 3 , рН 7-7,2 Bact. coli дает на среде Эндо колонии с металлическим блеском. Для изучения плесневых грибов используют среду Сабуро, следующего состава: 1% глюкозы, 1% пептона, 2% агар-агара рН 5-5.6.

ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:

Приготовить 100 мл МПА:

1. В кастрюлю напивают воду и ставят на горелку - готовят водяную баню.

2. В колбу наливают 100 мл МБ. Взвешивают 2 г. пептона. 0,5 г. агар-агара. Все это помещают в колбу с мясным бульоном.

3. Колбу ставят в кастрюлю с горячей водой и содержимое колбы подогревают до тех пор пока полностью не расплавится агар-агар и среда не станет однородной. Затем добавляют соды (до слабощелочной реакции по лакмусу).

4. Расплавленную среду разливают в пробирки по 10 мл.

5. Готовят ватные пробирки, обтягивают их марлей и закрывают пробки с приготовленной питательной средой.

6. Пробирки с МПА помещают в корзины. Сдают лаборанту для стерилизации.

Классификация питательных сред

По составу питательную среду подразделяют на 2 группы: натуральные среды неопределенного состава и синтетические среды.

Натуральными обычно называют среды, которые состоят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный хим. состав. Основой таких сред являются различные части зеленых растений, животные ткани. солод, дрожжи, фрукты, овощи... Большинство из них используется в виде экстрактов или настоев. Однако среды с неопределенным составом малопригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, поскольку они не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды, а с другой стороны выявить, какие вещества образуются по ходу развития м.о. Это связано с тем, что состав натуральных питательных сред очень сложен, кроме того он не является постоянным. Натуральные среды неопределенного состава используются главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. К числу сред неопределенного состава относят и так называемые среды «полусинтетические». В их состав наряду с известными хим. соединениями входят вещества неопределенного состава Такие среды находят широкое применение в пром. микробиологии для получения аминокислот, витаминов и антибиотиков. В качестве примера таких сред можно назвать: мясопептонная среда, в состав которой одновременно с мясным экстрактом и пептоном входит поваренная соль, фосфорнокислый каши, иногда глюкоза или сахароза, картофельные среды с глюкозой или пептоном.

Синтетические среды - это такие среды в состав которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в точно указанных концентрациях. Синтетические среды могут иметь относительно большой набор компонентов, но могут быть довольно простыми по составу. Синтетические среды наиболее удобны для исследования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и превращение в соответствующие продукты обмена

По назначению: различают элективные и дифференциально-диагностические среды

Элективные среды обеспечивают развитие преимущественно одного вида м.о. или группы родственных микроорганизмов (менее пригодны или совсем не пригодны для развития других). Такие среды применяют главным образом для выделения.

Микроорганизмов из мест их естественного обитания, для получения накопительных культур.

Дифференциально-диагностические среды : это такие среды, которые позволяют по возможности очень быстро отличить (дифференцировать) одни виды м.о. от других. Их состав подбирается с таким расчётом, чтобы он позволил чётко выявить наиболее характерные свойства данного вида м.о. Нередко это достигается введением в среды специальных красителей-индикаторов.

По физическому состоянию среды разделяют на жидкие, плотные и сыпучие. Для выяснения физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, а также для накопления их биомассы или продуктов обмена наиболее удобно применять жидкие среды. Плотные среды используют для выделения чистых культур. В промышленной биологии применяют так называемые сыпучие среды. К ним относятся разваренное пшено, пропитанное питательным раствором.

Вопросы для самоконтроля:

2. Как классифицируют их по агрегатному состоянию?

3. Как делятся питательные среды по назначению? В каких случаях удобнее применять те или иные среды?

4. Какие среды называют дифференциально-диагностическими?

5. Как готовят питательные среды? Какие студнеобразователи чаще всего применяют?

6. Что входит в состав МПА? Как его готовят?

7. Чем отличается МПА от МПЖ?

Домашнее задание:

1. Оформление отчета по лабораторному занятию.

2. Подготовиться к защите лабораторного занятия.

Лабораторная работа № 5

К 1000 мл мясопептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

Мясопептонный агар, охлажденный до температуры 50- - 55° С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 мл мясопептонного агара), по­мешают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горя­чий Мясопептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавли­вают в нем рН 7,0-7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерили­зуют в автоклаве при температуре 120° С.

Мясопептонный желатин

К мясопептонному бульону прибавляют мелко нарезанный желатин из расче­та ю-15 г на 100 мл. После набухания желатин растворяют при медленном нагревании в водяной бане при температуре 40-45 °С, устанавливают рН=7,0 10%-ным раствором бикарбоната натрия, фильтруют через бумажный фильтр в горячем виде. Среду разливают в пробирки по 5-8 мл, стерилизуют дробно 3 дня по часу при температуре 100° С или однократно при 110° С в течение 20 мин. После стерилизации среду охлаждают.

Пептонная вода

К 1000 мл дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают рН 7,2- 7,4, после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120° С.

Элективные среды для выявления возбудителей пищевых то кс и ко инфекций Среды фуксин - сульфитный агар (среда Эндо), бакто-агар Плоскирева, ме-тилен-эозиновая среда Левина, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) го­товят из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.

Среда Смирнова

К 1 л расплавленного МП А добавить 10-12 г лактозы и 4-5 мл 1,2% рас­твора бромкрезолпурпур. Стерилизовать дробно (или при 0,5 атм 20 мин).

Среды накопления сальмонелл Среда Мюллера Для приготовления среды Мюллера готовят вначале растворы серноватисто-кислого натрия и Люголя.

В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 мл Дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.

Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 мл бульона из перевара Хоттингера, содержащего 130- 150 мг % азота, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют 30 мин при температуре

120°С После стерилизации вновь устанавливают рН 7,2-7,4, для чего прове­ряют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровки дан­ного количества среды объем соляной кислоты или гидрата окиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добавляют по 2 мл раствора Лю-голя и по 10 мл раствора серноватистокислого натрия.

Таблица 1 Рост возбудителей пищевых токсикоинфекций на элективных средах и МПА

Название	Среда до	Кишечная	Сальмонелла
		Мелкие колонии	Мелкие колонии	Сплошной
	Розового	красного цвета с	цвета среды, цвет	рост, цвет
		металлическим	среды не меняет-	среды не
		оттенком, среда		меняется
		вокруг краснеет
Смирнова	фиолетово-	Мелкие колонии	Мелкие колонии	Сплошной
	го цвета	желтого цвета,	цвета среды, с	рост, цвет
		среда вокруг	голубым оттен-	среды не
			ком, цвет среды не меняется	меняется
	Коричнево-	Мелкие колонии	Мелкие колонии	Сплошной
	го цвета	темно-бурого	цвета среды, с	рост, цвет
		цвета, цвет сре-	сиреневым от-	среды не
		ды не меняется	тенком, цвет сре­ды не меняется	меняется
Плоскире-	Кирпично-	Мелкие колонии	Мелкие колонии	Отдельные
	красного	красного цвета,	цвета среды, сре-
		цвет среды не меняется	да вокруг немно­го просветляется	цвета среды
	Соломенно-	Мелкие колонии	Мелкие колонии	Сплошной
		серого цвета	серого цвета с	рост, цвет
			голубоватым от­тенком	среды не меняется

стр. 1

стр. 2

стр. 3

стр. 4

стр. 5

стр. 6

стр. 7

стр. 8

стр. 9

стр. 10

стр. 11

стр. 12

стр. 13

стр. 14

стр. 15

стр. 16

стр. 17

стр. 18

Цена 5 коп.

Издание официальное

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СТАНДАРТОВ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР

РАЗРАБОТАН Всесоюзным Государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов

Директор Бойко А. А.

Руководитель темы: Простяков А. П.

Исполнители темы: Агапова 3. А., Цыганкова С. И., Голикова Г. А.

ВНЕСЕН Министерством сельского хозяйства СССР

Член коллегии Третьяков А. Д.

ПОДГОТОВЛЕН К УТВЕРЖДЕНИЮ Всесоюзным научно-исследовательским институтом стандартизации (ВНИИС)

Директор Гличев А. В.

УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 9 апреля 1975 г. № 899

доводят в мерной колбе до 1 л, фильтруют через бумажный фильтр и хранят в темной склянке с притертой пробкой в темном месте. Реактив Д должен быть соломенно-желтого цвета без зеленого оттенка, затем в реактиве определяют концентрацию кислоты. Для этого приготовленный реактив разводят дистиллированной водой 1: 10 (1 мл реактива и 9 мл воды) и титруют 0,1 н. раствором гидрата окиси натрия по фенолфталеину (3-4 капли). Кислотность рассчитывают делением количества миллилитров 0,1 н. щелочи, израсходованного на титрование 1 мл реактива Д, на 10. Реактив Д имеет кислотность 1,6-2,3 Н.

Приготовление реактива Е

Реактив Е является реактивом Д, разведенным до 1 н. раствора. Например, если реактив Д является 2,3 н. раствором кислоты, то для приготовления 1 н. раствора Е надо брать 10 мл реактива Д и 13 мл дистиллированной воды

Построение градуировочного графика для определения белка

Готовят ряд растворов с определенным содержанием белка нисходящей концентрации от 0,10 до 0,01%, с которыми ставят цветную реакцию по п. 3.8.3. Для приготовления растворов можно использовать альбумин, миозин, нативную сыворотку. Содержание белка в растворах определяют по Кьельдалю. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре против воды Из оптической плотности растворов белка вычитают оптическую плотность контроля на реактивы и полученную величину откладывают по оси ординат. По оси абсцисс откладывают концентрацию белка в растворе (в процентах или в миллиграммах).

Разведение исследуемого образца для постановки цветной реакции выбирают такое, чтобы основное количество замеров по ве личине оптической плотности лежало в пределах 0,2-0,8, где точность измерения наиболее высокая.

3.8 3. Проведение испытания

В пробирку наливают 1 мл разведенного 1: 10 мясо-пептонного бульона, добавляют 5 мл реактива С, перемешивают и через 10 мин добавляют 0,5 мл реактива Е. Одновременно ставят конт роль на реактивы, для чего вместо мясо-пептонного бульона берут 1 мл дистиллированной вэды и добавляют те же реактивы, что и в пробирку с мясо-пептонным бульоном. Смесь хорошо перемешивают и ставят в темное место на 30-40 мин.

Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре с красным фильтром (630-640 нм) против воды в 5-миллиметро-вых кюветах. Из величин оптической плотности испытуемого образца вычитают величину оптической плотности контроля на реактивы. По полученным значениям оптической плотности растворов с помошью градуировочного графика определяют содержание бел-

ГОСТ 20730-75

ка в пробах. При расчете содержания белка в пробе учитывают кратность разведения перед постановкой цветной реакции.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,05%.

3.9. О п р е д е л е н и е содержания хлорида натрия

3.9.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения испытания применяют: весы аналитические;

элемент нагрева (горелку, плитку); пипетки по ГОСТ 1770-64 ; бюретки по ГОСТ 1770-64 ; стаканы лабораторные по ГОСТ 10394-63 ; квасцы железоаммонийные по ГОСТ 4205-68 , насыщенный ра~ створ;

3.9.2. Проведение испытания

Мясо-пептонный бульон в количестве 20 мл помещают в стакан и добавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты и 10 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра.

Полученную смесь нагревают до начала кипения и быстро охлаждают путем погружения стакана в сосуд с водой комнатной температуры. После охлаждения к смеси добавляют 2 мл насыщенного раствора железоаммонийных квасцов и титруют 0,1 н. раствором роданистого калия (или роданистого аммония) до появления желтовато-розового окрашивания.

3.9.3. Обработка результатов

(У к -У г К х) 0,005844-100

где V - количество 0,1 н. раствора азотнокислого серебра, взя* тое в стакан с пробой, мл;

К - поправочный коэффициент к титру 0,1 н. раствора азотнокислого серебра;

Vi - количество 0,1 н. раствора роданистого калия (или роданистого аммония), израсходованное на титрование испытуемой пробы, мл;

К\ - поправочный коэффициент к титру 0,1 н. раствора роданистого калия (или роданистого аммэния);

0,005844 - количество хлэрида натрия, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра;

V 2 - количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, мл.

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,01%.

3.10. Определение концентрации водородных ионов (pH)

3.10.1. Аппаратура и материалы

Для проведения испытания применяют: рН-метр;

воронки стеклянные;

пробки ватномарлевые;

фильтры бумажные;

ГОСТ 13805-68 ГОСТ 17206-71 .

3.11.2. Подготовка к испытанию

Готовят в соответствии с действующей рецептурой, мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептон-ный-печеночный бульон (МППБ) под маслом (среда Кип-Тар оц-ци). Среды разливают по 8-10 мл в проблрки, закрывают ватномарлевыми пробками и пергаментными колпачками и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 1,5 кгс/см 2 .

3.11.3. Проведение испытания

Мясо-пептонный бульон (всю серию) в реакторе или в бутылях выдерживают в течение трех дней при комнатной температуре.

Взятую стерильно пробу мясо-пептонного бульона расфасовывают по 100 мл в четыре флакона вместимостью 200 мл. Затем высевают мясо-пептонный бульон в пробирки с МПБ, МПА и МППБ. Посевы производят в 6-8 пробирок с каждой средой. Посев производят добавлением в каждую пробирку по 0,2 мл испытываемого мясо-пептонного бульона. Пробирки и флаконы выдерживают в течение трех дней в термостате при температуре 37-38°С. Среды в пробирках и мясо-пептонный бульон во флаконах должны оставаться стерильными.

3.11.4. Обработка результатов

При наличии роста микрофлоры в реакторе или бутылях серия мясо-пептонного бульона бракуется. При наличии роста микрофлоры во всех флаконах и пробирках серия мясо-пептонного бульона также бракуется.

При наличии роста микрофлоры в одном флаконе или в одной-двух пробирках контроль на стерильность повторяют на удвоенном количестве флаконов а пробирок. При повторном росте микрофлоры серию мясо-пептонного бульона бракуют.

3.12. Определение способности поддерживать рост микробов

3.12.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения испытания применяют: весы технические;

термостат;

автоклав;

воронки стеклянные;

пробки ватномарлевые;

фильтры бумажные;

пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805-68 ; агар микробиологический по ГОСТ 17206-71 .

3.12.2. Подготовка к испытанию

Готовят согласно действующей рецептуре на основе испытуемого мясо-пептонного бульона мясо-пептонный агар, добавляя к бульону 2% микробиологического агара, и устанавливают pH среды 7,4.

Испытуемый мясо-пептонный бульон и приготовленный мясо-пептонный агар разливают по 8-10 мл в пробирки, закрывают ватномарлевыми пробками и пергаментными колпачками и стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при 1,5 кгс/см 2 .

3.12.3. Проведение испытания

Стерильный мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар засевают суточными культурами: Staphylococcus aureus «Лассма-нов», Esherichia coli, штамм 675, Streptococcus faccalis, штамм 6783, полученными из Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских препаратов им. Л. А. Тарасевича. Посев каждой культуры производят пастеровской петлей в три пробирки с МПБ и в три пробирки с МПА. Инкубацию проводят в течение 24 ч в термостате при 37-38°С.

Рост культуры должен быть типичным и обильным.

3.12.4. Обработка результатов

Типичность роста суточных культур определяют визуально и под микроскопом.

Интенсивность роста на МПА оценивают визуально, в МПБ - визуально и на фотоэлектроколориметре при длине волны 620- 640 нм в кюветах с рабочей длиной 5 мм.

4. РАСФАСОВКА, УПАКОВКА, МАРКИРОВКА, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ

4.1. Мясо-пептонный бульон стерильно расфасовывают в стеклянные бутыли (баллоны) вместимостью 10±0,5 и 20±1 л. Допускается более мелкая расфасовка - флаконы вместимостью 200 и 500 мл.

4.2. Бутыли закрывают стерильными резиновыми пробками по ГОСТ 7852-65 , которые сверху завязывают пергаментной бумагой. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками.

4.3. На бутыли и флаконы наклеивают бумажные этикетки с указанием:

наименования препарата;

количества препарата в л;

номера серии препарата;

даты изготовления;

срока годности;

условий хранения;

обозначения настоящего стандарта.

4.4. Мясо-пептонный бульон хранят в реакторе или в бутылях в чистом, сухом и темном помещении при температуре 4-10°С.

4.5. Мясо-пептонный бульон транспортируют всеми видами транспорта при соблюдении условий хранения, указанных в п. 4.4. Допускается транспортирование при более высокой температуре, но не выше 18°С, при этом срок транспортирования должен быть не более пяти суток.

ГОСТ 20730-75

4.6. Срок годности мясо-пептонного бульона 6 месяцев со дня изготовления. По истечении указанного срока мясо-пептонный бульон подвергают испытанию и в случае соответствия требованиям, установленным настоящим стандартом, срок годности может быть продлен еще на 3 месяца.

Редактор Я. Е. Шестакова Технический редактор В. Ю. Смирнова Корректор И. Л, Хиниц

Сдано в наб. 18 04 75 Подп. в печ. 25 05 75 1,0 п. л. Тир. 6000 Цена 5 коп.

Издательство стандартов. Москва, Д-22, Новопресненский пер., 3 Тип. «Московский печатник». Москва, Лялин пер.. 6. Зак. 683

Пункты 3.4.1, 35.1, 3.6 1, 3.7.1, 38 1, 3.9 1, 3.11.1, 3 12 1. Заменить ссылку ГОСТ 1770-64 на ГОСТ 1770-74 .

Пунмы 3 1 I, 3.5.1, 3.9.1, 3 10.1. Заменить ссылку: ГОСТ 10394-63 на ГОСТ 25336_82

Пункты 3.4.1, 3.5.1, 3.6.1, 3.8.1. Заменить ссылку: ГОСТ 4328-66 на ГОСТ 4328-77 .

Пункты 3.6.1, 3.8.1, 3.11.1, 3.12.1. Заменить ссылку: ГОСТ 10515-75 на ГОСТ 25336_82

Пункт 3.6.1. Исключить слова: «фильтры бумажные», «воронки стеклянные по ГОСТ 8613-64 »;

дополнить абзацем: «центрифуги настольные типа ОПН-8-14,2».

Пункт 3.6.3. Третий абзац. Заменить слова: «Через 2 мин смесь фильтруют через бумажные фильтры» на «Через 2 мин смесь центрифугируют 10 мин с частотой вращения 3000 -4000- 1 ».

Пункт 3.9.2. Второй абзац изложить в новой редакции: «2 см 3 мясопептон-ного бульона помещают в стакан, добавляют 20 см* воды, 1 см 3 концентрированной азотной кислоты и 10 см 3 0,1 н. раствора азотнокислого серебра».

Пункт 3.9.3. Формулу изложить в новой редакции:

(VK-V X K X) 0,005844 100 Х 3 - Vt

Пункты 3.11.1, 3.12.1. Заменить ссылки: ГОСТ 13805-68 на ГОСТ 13805-76 , ГОСТ 17206-71 на ГОСТ 17206-84 .

Раздел 4. Наименование. Исключить слово: «расфасовка».

(ИУС № 11 1989 г.)

УДК 576.8.093.1(083.74) Группа Р35

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ. БУЛЬОН МЯСО-ПЕПТОННЫЙ (ДЛЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ ЦЕЛЕЙ)

Meat-pep ton broth (for veterinary)

Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 9 апреля 1975 г. Нй 899 срок действия установлен

с 01.01 1976 г. до 01.01 1981 г.

Несоблюдение стандарта преследуется по закону

Настоящий стандарт распространяется на мясо-пептонный бульон, представляющий собой питательный раствор, предназначенный для выращивания микроорганизмов.

1. ТЕХНИЧЕСКИЕ ТРЕБОВАНИЯ

1.1. Мясо-пептонный бульон должен изготавливаться в соответствии с действующими правилами по ведению технологического процесса, утвержденными в установленном порядке.

1.2. Мясо-пептонный бульон по физико-химическим, биохимическим и биологическим показателям должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл. 1.

Таблица I

Продолжение

Характеристика и нормы

Наименования показателей

Стерильность

2,7 3,0-3,4 0,5 0,5 7,2-7,6

Посев на питательные среды не должен давать роста микрофлоры в течение трех суток в термостате при 37- 38°С

Способность поддерживать рост микробов, оптическая плотность, не менее.

Staphylococcus aureus «Лассма-нов»

Escherichia со И штамм 675

Streptococcus faccalis штамм 6783

2. ПРАВИЛА ПРИЕМКИ

2.1. Мясо-пептонный бульон сдают и принимают сериями.

2.2. Каждая серия мясо-пептонного бульона на предприятиях биологической промышленности Министерства сельского хозяйства СССР должна быть принята государственным контролером Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.

2.3. Под серией следует понимать любое количество мясо-пептонного бульона, изготовленное за один технологический цикл, в одной емкости (реакторе) и оформленное одним документом о качестве.

2.4. Для проверки качества препарата от каждой серии мясо-пептонного бульона более 50 л отбирают 2 л, при объеме менее 50 л - 0,6 л.

Если вся серия мясо-пептонного бульона расфасована в бутыли, делают выборку в количестве одной бутыли. Если мясо-пептонный бульон расфасован во флаконы, составляют выборку такого количества флаконов, чтобы объем мясо-пептонного бульона в отобранных флаконах соответствовал указанной выше норме, которая установлена в зависимости от общего объема серии мясо-пептонного бульона.

2.5. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному из показателей серию мясо-пептонного

бульона считают не соответствующей требованиям настоящего стандарта.

2.6. Контрольную проверку образцов по требованию потребителя проводит Всесоюзный государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства СССР.

3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИИ

3.1. Методы отбора проб

3.1.1. Пробу мясо-пептонного бульона в количестве 2 или 0,6 л (в зависимости от объема серии препарата) отбирают из реактора или бутыли стерильно.

Пробу объемом 2 л расфасовывают в 10 флаконов по 200 мл. Пять флаконов используют для анализа, а пять - оставляют в архиве государственного контролера.

Пробу, отобранную от серии мясо-пептонного бульона объемом менее 50 л, в архиве не оставляют.

3.2. Внешний вид, цвет, наличие механической примеси, плесени, хлопьев и осадка устанавливают, просматривая флаконы и бутыли с мясо-пептонным бульоном в проходящем свете, для чего флаконы встряхивают, переворачивая вниз пробками, а бутыли покачивают.

3.3. Запах мясо-пептонного бульона определяют в пробе органолептически

3.4. Определение содержания общего азота

3.4.1. Аппаратура и реактивы

Для проведения испытания применяют: весы аналитические;

колбу Кьельдаля вместимостью 50-100мл по ГОСТ 10394-63 ; аппарат микро-Кьельцаль; элемент нагрева (плитку, горелку); пипетки на 1, 2, 5 мл по ГОСТ 1770-64 ; бюретки по ГОСТ 1770-64 ; воду дистиллированную по ГОСТ 6709-72 ; кислоту серную по ГОСТ 4204-66 , концентрированную и 0,1 н. раствор;

За окончательный результат испытания принимают разность между средними арифметическими двух параллельных определений в опытных и контрольных пробах. Допускаемые расхождения между результатами двух параллельных определений не должны превышать ±0,5%.

3.5. О п р е д е л е н и е содержания азота аминогрупп аминокислот и низших пептидов

3.5.1. Аппаратура, материалы и реактивы Для проведения испытания применяют: рН-метр;

3.5.2. Подготовка к испытанию

Непосредственно перед проведением анализа готовят формоль-ную смесь. Для этого к 50 мл формалина добавляют 1 мл 1%-ного раствора фенолфталеина и 0,1 н. раствором гидрата окиси натрия доводят смесь до слаборозового цвета.

3.5.3. Проведение испытания

К 2 мл мясо-пептонного бульона приливают 18 мл дистиллированной воды и доводят 0,1 н. раствором гидрата окиси натрия pH смеси до 7,0. Затем приливают 2 мл формольной смеси и при постоянном перемешивании потенциометрически титруют 0,1 н. раствором гидрата окиси натрия до pH 9,2.

Одновременно ставят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо 2 мл мясо-пептонного бульона берут 2 мл дистиллированной воды.

3.5.4. Обработка результатов

v (V-V\) * К 0,0014.100

где V - количество 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование испытуемой пробы, мл;

Vj - количество 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, израсходованное на титрование в контрольном опыте, мл;

К - поправочный коэффициент к титру 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия;

0,0014 - количество азота, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора гидрата окиси натрия, г;

2 - количество мясо-пептонного бульона, взятое на анализ, мл.

ГОСТ 20730-75

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±0,2%.

3.6.3. Проведение испытания

В пробирку наливают 10 мл мясо-пептонного бульона в разведении 1: 10, прибавляют по 1 мл 10%-ного раствора гидрата окиси натрия и 2%-ного раствора сернокислой меди. Смесь после добавления каждого реактива хорошо встряхивают.

Одновременно проводят контрольный опыт на реактивы, для чего вместо 10 мл разведенного мясо-пептонного бульона берут 10 мл дистиллированной воды.

Через 2 мин смесь фильтруют через бумажные фильтры. Интенсивность окраски измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волн 540-560 нм или спектрофотометре при 540 нм в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

3.6.4. Обработка результатов

Концентрацию истинного пептона в мясо-пептонном бульоне определяют по градуировочному графику.

Оптическая плотность (Е) мясо-пептонного бульона равна разности оптических плотностей в опыте с испытуемой пробой и в

контрольном опыте. Полученную по графику концентрацию истинного пептона умножают на 10 (т. е. на разведение мясо-пептонного бульона).

За окончательный результат испытания принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений. Допускаемые расхождения между результатами параллельных определений не должны превышать ±5%.

3.7. О п р е д е л е н и е содержания сухого вещества

3.7.1. Аппаратура

Для прозедения испытания применяют:

весы аналитические;

шкаф сушильный лабораторный по ГОСТ 7365-55 ;

стаканчики для взвешивания (бюксы) по ГОСТ 7148-70 ;

3.7.2. Проведение испытания

В предварительно высушенную до постоянной массы бюксу взвешивают с погрешностью не более 0,0002 г мясо-пептонный бульон в количестве 1,0-1,2 г. Затем бюксу с мясо-пептонным бульоном высушивают в сушильном шкафу при температуре 100-105°С до постоянной массы. Высушивание продолжают до тех пор, пока разность между двумя последующими взвешиваниями будет не более 0,0002 г.

Примечание. Увеличение массы при одном из взвешиваний в процессе высушивания при расчете не учитывают.

3.7.3. Обработка результатов

уг _ (т 2 - т) 100

где т - масса пустой бюксы с крышкой, г;

Ш\ - масса бюксы с крышкой и с мясо-пептонным бульоном до высушивания, г;

1%-ный раствор; медь сернокислую по

Реактив С готовят непосредственно перед определением путем смешивания 50 частей реактива А и 1 части реактива В. Приготовление реактива Д

Реактив Д (реактив Фолина) готовят в круглодонной на 1 л колбе из огнеупорного стекла с обратным холодильником.

В колбу помещают 100 г вольфрамовокислого натрия, 25 г молибденовокислого натрия и 700 мл дистиллированной воды. После полного растворения солей в колбу добавляют 50 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое колбы сстсрожно, но хорошо перемешивают. К колбе присоединяют обратный холодильник и смесь кипятят (не слишком сильно) в течение 10 ч. Кипячение можно вести с перерывом, но учитывают лишь период кипения.

После окончания кипячения в смесь добавляют 150 г сернокислого лития, 50 мл дистиллированной воды и 5 капель брома (осторожно). Для удаления излишка брома раствор кипятят 15мин без холодильника под тягой. После охлаждения готовый раствор